如何提高新型冠状病毒核酸检测的准确性?

浏览数:459
2019新型冠状病毒感染的肺炎疫情蔓延严重,《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》推荐使用核酸检测方法用于新型冠状病毒的常规检测。随着疫情的不断加重,核酸检测需求大幅增加,但是随之而来,核酸检测结果的准确性引起广泛关注,“漏检”情况使一些临床医生和民众对检测试剂盒的质量提出了疑问。那么,有可能影响目前核酸检测准确性的因素有哪些呢?下面从标本采集、标本保存及运送、核酸提取、扩增检测等环节谈一下如何提高新型冠状病毒核酸检测的准确性。


1

标本采集

正确取样是实验成功的关键。据了解,由于可操作性的限制,目前比较常见的采样方法是使用鼻咽拭子、痰液或肺泡灌洗液采集,最常用的方法为采集鼻咽拭子标本。但是鼻咽拭子的取样技术会影响检测的准确性,最好由经过培训的护士给患者取样,需要从患者鼻咽部采集到足够有效的细胞,经验不足的护士可能获取不到合格的标本。

另外,进行标本采集所使用的鼻咽拭子和保存液,对采集到的标本质量和保存效果也会有影响,推荐使用可以吸附和释放更多样本的无菌植绒拭子以及无游离DNA酶和RNA酶的细胞保存液,可以更好地保存病毒核酸,避免新型冠状病毒RNA降解。

鼻咽拭子采样图

标本采集工具


2





标本保存及运送

新型冠状病毒为RNA病毒,在标本保存和运送时需特别注意保存温度及相应时间长短,避免核酸降解,造成假阴性。标本采集后应尽快送检,采集后在2h~4h内送到实验室。血液标本室温运送,其他标本在2℃~8℃下转运;若运送时间超过24h,标本宜在-70℃或更低的温度下保存,短距离转运应在2℃~8℃下进行,长距离转运应采用干冰运输。标本运送保存期间应避免反复冻融。

3






核酸提取

核酸检测对实验室、设备、人员和试剂有较高的要求。需要专门的PCR实验室分区才能保证检测结果的准确性。核酸提取是进行核酸检测中至关重要的一步。

目前批准的试剂盒中只包含新型冠状病毒核酸检测所需的扩增试剂,未包含核酸提取试剂。不同核酸提取试剂或提取仪的提取效率可能存在差异,推荐使用已经验证过的提取方法和提取试剂进行核酸提取,以保证检测结果的准确性

为保证检测人员安全和核酸提取的纯度和效率,可采用基于磁珠吸附的自动化核酸提取方法。多家权威实验室和相关专家建议采用体积小巧的半自动核酸提取仪,放入生物安全柜中,在安全柜中完成样本加样和核酸提取的全部步骤,简便高效,保护操作者安全


图片来源于北京协和医院培训视频的截图


4







扩增检测

新型冠状病毒的核酸检测主要针对新型冠状病毒基因组中开放读码框1ab(ORF1ab)和核壳蛋白(N)、包膜蛋白(E)进行检测。在实验室要确认一个病例为阳性,满足以下条件:同一份标本中3个靶标(ORF1ab、N、E)特异性实时荧光RT-PCR检测结果两个以上(含两个)阳性。如果出现单个靶标阳性的检测结果,则需要重新采样,重新检测。

阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染,需要排除可能产生假阴性的因素,包括:标本质量差,比如口咽等部位的呼吸道样本;标本收集的过早或过晚;没有正确的保存、运输和处理样本;技术本身存在的原因,如PCR抑制等。

因疫情蔓延严重,新型冠状病毒核酸检测试剂盒研发、应急审批的推进紧迫,前期可能缺乏足够临床样本验证数据,存在灵敏度和特异性优化不够充分的风险。各厂家试剂性能和阳性检出率存在差别,多数试剂盒只检测ORF1ab和N基因这2个靶标,部分试剂单靶标阳性结果占阳性结果的20%以上。对单靶标阳性结果及可疑结果建议采用不同试剂盒进行复核,或送CDC确证但会增大工作量,延迟确诊时间。从公开信息来看,目前批准的试剂都不含UNG酶和dUTP防污染系统存在污染和假阳性风险。

复星推出的新型冠状病毒核酸检测试剂盒可检测ORF1ab基因和N基因、E基因等3靶标,S型扩增曲线结果更易判读;同时全程内参监控,可有效监控提取、逆转录和扩增等整个检测过程,避免假阴性结果;并具有防污染体系,采用UNG酶和dUTP防污染系统有效防止扩增产物污染,避免假阳性结果;搭配自动核酸提取仪可在2小时内完成96个样本的全部检测。

复星新冠试剂60例临床样本的核酸扩增曲线


某品牌新冠试剂60例临床样本的核酸扩增曲线


“持续创新,共享健康”是每个复星人的追求,希望以上产品和建议可帮助实验室安全、快速、省力地进行新型冠状病毒的应急检测,早日赢得疫情防控的的最终胜利!


参考文献

[1]《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第四版)》

[2]《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)》

[3]《 新型冠状病毒感染的肺炎防控方案(第四版)》

[4]《新型冠状病毒实验室生物安全指南(第二版)》

[5] 2019-新型冠状病毒(2019-nCov)核酸检测建议,中华医学会检验医学分会分子诊断学组,IVD资讯第一平台

[6] 新型冠状病毒流行地区临床实验室常见问题解答(第一版),华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科,检验医学网

[7] 新型冠状病毒核酸检测标准操作流程的培训视频来了!北京协和医院,协和医生说

[8] 新型冠状病毒(2019-nCoV)对医院检验科实验室的要求及防控建议,曹国庆,洁净室网与咖

[9] WHAT?4名检验科医生从未接触病人,却被感染新冠病毒???体外诊断网

[10] 检测4次才确诊?!试剂盒产能上去了,为什么确诊还是那么难?21世纪经济报道

[11] 试剂盒问题:为什么一盒难求?为什么“病愈”患者会阴转阳?医学界